RakKrtani apoptoza i proliferacja, Medycyna
[ Pobierz całość w formacie PDF ]
Gryczyñski M., Wioletta Pietruszewska W.: Wybrane aspekty apoptozy i proliferacji komórkowej raka krtani
CHOROB
Y JAMY USTNEJ, GARD£
Y JAMY USTNEJ, GARD£
A I KRT
Otorynolaryngologia, 2002, 1(1), 1-11
A I KRT
ANI
ANI
151
Otorynolaryngologia, 2002, 1(3), 151-160
ybrane aspekty apoptozy i proliferacji komórkowej
raka krtani
raka krtani
The selected aspects of apoptosis and cell proliferation of laryngeal cancer
yngeal cancer
M
ACIEJ
G
RYCZYÑSKI
, W
IOLETTA
P
IETRUSZEWSKA
Katedra Otolaryngologii i Klinika Laryngologii Uniwersytetu Medycznego, ul. Kopciñskiego 22, 90-153 £ódŸ
Mimo rozwoju metod diagnostycznych i leczniczych rak krtani nadal po-
zostaje istotnym problemem onkologicznym. Do czynników o uznanym zna-
czeniu rokowniczym u chorych na raka krtani nale¿¹ m.in. klasyfikacja TNM
i stopieñ zró¿nicowania histologicznego nowotworu. WskaŸniki te czêsto nie
s¹ wystarczaj¹ce w diagnozowaniu, monitorowaniu przebiegu choroby,
prognozowaniu czasu prze¿ycia chorych i zawodz¹ przy podejmowaniu
decyzji o rozleg³oœci zabiegu chirurgicznego (zw³aszcza wêz³ów ch³onnych
szyi), jak równie¿ dodatkowego napromieniania lub chemioterapii. Badania
ostatnich lat podnosz¹ prognostyczne znaczenie oceny biologii nowotwo-
rów i zwi¹zanych z ni¹ procesów proliferacji komórkowej i apoptozy. Aktyw-
noœæ proliferacyjna nowotworu zwi¹zana jest z szybkoœci¹ jego wzrostu,
a okreœlenie wielkoœci frakcji wzrostowej jest uznanym wskaŸnikiem w pro-
gnozowaniu czasu prze¿ycia chorych na ró¿ne nowotwory. Apoptoza jest
ci¹giem zdarzeñ morfologicznych, biochemicznych i molekularnych prowa-
dz¹cych do œmierci komórki, a kluczow¹ rolê w jej regulacji odgrywaj¹ bia³ka
P53 i Bcl2. W pracy omówiono podstawowe pojêcia dotycz¹ce apoptozy
i proliferacji komórkowej, opisano morfologiczne i biochemiczne cechy ko-
mórki apoptotycznej oraz geny i bia³ka P53, Bcl2 i Ki67. W oparciu o w³asne
doœwiadczenie wskazano na prognostyczn¹ wartoœæ oceny ekspresji po-
wy¿szych genów i bia³ek u chorych na raka krtani. Podkreœlono równie¿
zale¿noœci miêdzy procesami apoptozy i proliferacji w raku krtani a mo¿liwo-
œci wykorzystania oceny tych procesów w diagnozowaniu, leczeniu i moni-
torowaniu chorych na raka krtani oraz na inne z³oœliwe nowotwory lite.
Otorynolaryngologia, 2002, 1(3), 151-160
Despite of constant progress of diagnostic and treatment methods
laryngeal cancer is still essential oncological problem. TNM classification and
histological grading are the recognised prognostic factors in patients with
laryngeal cancer. They are often not satisfactory in diagnosing, monitoring
and prognosis of survival in individual patient. They also mislead in making
decision on the range of the operation (particularly type of lymphadenecto-
my) and additional treatment (radiotherapy and chemotherapy). The recent
research studies are focused on the prognostic value of some biological
features and processes in tumours cells and the relation to proliferation and
apoptosis. As the tumour proliferation seems to be associated with tumour
growth, the evaluation of the growth fraction is recognised as prognostic
factor in patients with various cancers. The apoptosis is another chain of
morphological, biochemical and molecular reactions leading to the cell death
with current key role of p53 and Bcl2 proteins. The authors indicated
prognostic value of these protein expression in patients with laryngeal
cancer and also emphasized relations between discussed processes of apop-
tosis and proliferation and their application in diagnosing, treatment and
follow-up of the patients with laryngeal cancer and other solid tumours.
Otorynolaryngologia, 2002, 1(3), 151-160
Key words: laryngeal cance, apoptosis, cell proliferation, prognostic factor
S³owa kluczowe: rak krtani, apoptoza, proliferacja komórkowa, czynnik
rokowniczy
Mimo ci¹g³ego udoskonalania metod diagnostycz-
nych i leczniczych rak krtani nadal pozostaje istotnym
problemem onkologicznym. Do czynników o uznanym
znaczeniu rokowniczym u chorych na raka krtani nale¿¹
m.in. klasyfikacja TNM zaakceptowana przez Komitet
Miêdzynarodowej Unii do Walki z Rakiem [1] i oparte
na niej stopnie zaawansowania choroby oraz stopieñ zró¿-
nicowania histologicznego nowotworu [2]. WskaŸniki
te czêsto nie s¹ wystarczaj¹ce w diagnozowaniu, monito-
rowaniu przebiegu choroby i prognozowaniu czasu prze-
¿ycia chorych. Klasyczne czynniki rokownicze czêsto rów-
nie¿ zawodz¹ w podejmowaniu decyzji o rozleg³oœci za-
biegu chirurgicznego, a zw³aszcza operacji wêz³ów ch³on-
nych szyi i koniecznoœci podjêcia dodatkowego napromie-
niania lub chemioterapii. Uzasadnione s¹ wiêc poszuki-
wania niezale¿nych wskaŸników prognostycznych, które
u³atwia³yby wybór tego postêpowania. W ostatnich la-
tach w badaniach nad nowotworami wzros³o zaintereso-
wanie apoptoz¹ oraz zaburzeniami przebiegu cyklu ko-
mórkowego jako istotnymi czynnikami przyczyniaj¹cy-
mi siê do powstawania i rozwoju nowotworów. Uwa¿a
siê, ¿e pojawienie siê i rozprzestrzenianie nowotworu to
nie tylko nagromadzenie w komórkach zmian genetycz-
nych powsta³ych w konsekwencji nadekspresji, wzglêdnie
CHOROB
Y JAMY USTNEJ, GARD£
A I KRT
ANI
Wybrane aspekty apoptozy i proliferacji komórkowej
ybrane aspekty apoptozy i proliferacji komórkowej
The selected aspects of apoptosis and cell proliferation of lar
Key words:
S³owa kluczowe:
152
Otorynolaryngologia, 2002, 1(3), 151-160
mutacji, protoonkogenów lub utraty, b¹dŸ zmian, genów
supresorowych transformacji nowotworowej. Równie
istotnym czynnikiem w procesie nowotworowym jest
obni¿enie zdolnoœci komórek do prawid³owego umiera-
nia, tj. apoptozy, jako odpowiedzi na bodŸce pochodz¹ce
ze œrodowiska otaczaj¹cego komórkê. Doprowadziæ to
mo¿e do nieprawid³owego zwiêkszenia ¿ywotnoœci i wy-
d³u¿enia ¿ycia komórek oraz utrwalania ju¿ zaistnia³ych
mutacji, a tak¿e do wyst¹pienia zaburzeñ cyklu komór-
kowego. Z drugiej strony wady w kontroli cyklu komór-
kowego s¹ jedn¹ z najwa¿niejszych przyczyn procesu
nowotworzenia. Przywracanie sprawnego nadzoru nad
cyklem komórkowym mo¿e przyczyniæ siê do pozytyw-
nych rezultatów w leczeniu nowotworów.
minacja niedojrza³ych limfocytów T i B). Tego rodzaju
proces warunkuje prawid³owy rozwój i funkcjonowanie
organizmu, a tak¹ apoptozê nazywa siê zaprogramowan¹
rozwojowo.
Kolejny rodzaj to zaprogramowana œmieræ komórki
w odpowiedzi na bezpoœrednie dzia³anie czynników bio-
chemicznych lub fizycznych (promieniowanie jonizuj¹-
ce) i stanowi obecnie przedmiot badañ naukowych
[9,10,11,12].
Zbli¿ony do powy¿szego rodzaj apoptozy towarzy-
szy obumieraniu komórek w rozwoju nowotworów lub
w okresie regresji hiperplastycznych organów lub tkanek.
Wówczas jest ona wywo³ana samym procesem patolo-
gicznym, a nie odpowiedzi¹ na czynnik powoduj¹cy dany
stan. Mówi¹c inaczej nowotwór, a nie karcynogen sty-
muluje rozwój tego procesu. Rola apoptozy w powstawa-
niu nowotworów nie jest do koñca okreœlona. Wystêpo-
wanie tego zjawiska w obrêbie guza mo¿e powodowaæ
utratê nieœmiertelnoœci komórek raka, a tym samym unie-
mo¿liwiaæ rozwój nowotworu. Apoptoza mo¿e zarówno
hamowaæ rozwój komórek nowotworowych, jak równie¿
stymulowaæ ich klonowy rozwój poprzez eliminacjê s¹-
siaduj¹cych komórek.
Apoptoza – zaprogramowana œmieræ komórki
Wyró¿nia siê dwa g³ówne mechanizmy œmierci ko-
mórek, tj. martwicê i apoptozê, które istotnie ró¿ni¹ siê
biochemicznie i morfologicznie. Martwica jest procesem
biernym i przypadkowym, wywo³ywanym przez zmiany
w otoczeniu komórki, takie jak niedokrwienie, gwa³tow-
ne zmiany temperatury lub uraz mechaniczny, które po-
woduj¹ nieodwracalne uszkodzenia uporz¹dkowanej
struktury komórkowej. W samych komórkach wystêpu-
j¹ wczesne zaburzenia w funkcji mitochondriów i b³on
komórkowych, co prowadzi do zmian regulacji ciœnienia
osmotycznego, zwiêkszenia objêtoœci komórek, a w koñ-
cowym etapie – ich rozpadu i œmierci. W wyniku mar-
twicy zawartoœæ umieraj¹cych komórek (np.: enzymy pro-
teolityczne) zostaje uwolniona do przestrzeni pozakomór-
kowej, co wywo³uje lub zwiêksza miejscowy stan zapalny
przyczyniaj¹c siê do uszkodzenia s¹siednich komórek i
tkanek [3,4].
Okreœlenie apoptoza zosta³o wprowadzone w 1972 r.
[5] i pochodzi z jêz yka greckiego, a oznacza opadanie
p³atków z kielicha kwiatów lub liœci z drzew. Synonimy
apoptozy to „samobójcza”, aktywna, fizjologiczna lub
nieprzypadkowa œmieræ komórki, martwica „obkurcze-
niowa”, a tak¿e programowana œmieræ komórki (ang. pro-
grammed cell death). Jest ona procesem czynnym, uwa-
runkowanym genetycznie, przeciwstawnym mitozie i ró¿-
nym od martwicy. Stanowi ci¹g zdarzeñ morfologicznych,
biochemicznych i molekularnych, które w konsekwencji
prowadz¹ do œmierci komórki. Zapocz¹tkowanie apop-
tozy wymaga aktywacji wielu genów m.in. p-53, mdm2,
bcl-xS, bax i hamowania ekspresji innych np. bcl-2, bcl-
xL [3,4,6-8]. Ma ona podstawowe znaczenie w embrio-
genezie (np. obumieranie przewodu Müllera u embrio-
nów p³ci mêskiej), w przebiegu inwolucji narz¹dów (ob-
umieranie tymocytów w okresie rozwoju osobniczego),
w procesach odnowy i regeneracji tkanek oraz w zakoñ-
czeniu ¿ycia komórek zró¿nicowanych (apoptoza leuko-
cytów, komórek nab³onka skóry lub jelit, komórek en-
dometrium w okresie poprzedzaj¹cym menstruacjê, eli-
Cechy morfologiczne i biochemiczne komórki
apoptotycznej
Morfologia komórki gin¹cej z powodu apoptozy
znacznie siê ró¿ni od obrazu komórki nekrotycznej. Pro-
ces programowanej œmierci rozpoczyna siê w j¹drze ko-
mórkowym, w którym dochodzi do kondensacji i agre-
gacji chromatyny, a tym samym do zmniejszenia objêto-
œci j¹dra. Sprawia ono wra¿enie zapadniêtego i skurczo-
nego, przy zachowanej integralnoœci b³on i czynnoœci
organelli. W nastêpnym etapie, z powodu utraty wody,
dochodzi do zmniejszenia objêtoœci ca³ej komórki, na-
wet do ok. 30-50%. W koñcowej fazie apoptozy ulega ona
fragmentacji i powstaj¹ otoczone b³on¹ komórkow¹ kwa-
soch³onne cz¹steczki zwane cia³kami apoptotycznymi (ang.
apoptotic body) zbudowane z czêœci zagêszczonej chro-
matyny, organelli i cytozolu. [4,13]. Komórki i cia³ka apop-
totyczne s¹ usuwane z tkanek w procesie fagocytozy, w któ-
rym istotn¹ rolê odgrywa obecnoœæ receptora witronekty-
nowego na b³onie komórkowej makrofagów [3,14]. Apop-
totyczna œmieræ komórek oraz ich fagocytoza nie powo-
duj¹ uwolnienia enzymów proteolitycznych, nie towarzy-
szy wiêc jej reakcja zapalna, a œmieræ poszczególnych ko-
mórek nie wywo³uje rozleg³ej destrukcji tkanek.
Programowana œmieræ komórki jako proces aktywny
wymaga dostarczenia energii i charakteryzuje siê wzmo-
¿on¹ syntez¹ RNA i bia³ek, jak równie¿ pobudzeniem
czynnoœci enzymów komórkowych. W wyniku pobudze-
nia endonukleaz (NUC 18, DNAzy I, DNAzy II) kata-
lizuj¹cych rozerwanie wi¹zañ wewn¹trznukleosomalnych,
dochodzi do fragmentacji DNA na odcinki bêd¹ce
Gryczyñski M., Wioletta Pietruszewska W.: Wybrane aspekty apoptozy i proliferacji komórkowej raka krtani
153
wielokrotnoœci¹ nukleosomów (180-200 par zasad), sta-
nowi¹cej prawdopodobnie pierwszy, nieodwracalny etap
apoptozy. W procesie apoptozy stwierdzono tak¿e wzrost
aktywnoœci topoizomeraz (topo I i topo II – generuj¹ jed-
no- lub dwuniciowe pêkniêcia w helisie DNA), enzy-
mów proteolitycznych (umo¿liwiaj¹ przemianê nieczyn-
nych form prekursorowych endonukleaz w aktywne),
transglutaminaz tkankowych (powoduj¹ powstawanie
wi¹zañ miêdzy bia³kami cytoplazmatycznymi, co prowa-
dzi do kurczenia siê komórek i zmiany ich kszta³tu) oraz
enzymów: gamma-glutamylo-transpeptydazy, rybonukle-
azy i aktywatora plazminogenu. Cech¹ charakterystycz-
n¹ w wiêkszoœci komórek indukowanych do apoptozy jest
tak¿e wzrost stê¿enia jonów wapniowych w cytozolu ko-
mórkowym, bêd¹cych aktywatorami zarówno endonu-
kleaz jak i transglutaminaz tkankowych niezbêdnych
podczas tworzenia cia³ek apoptotycznych [3,8,14-16].
Do wykrywania apoptozy stosuje siê m.in.: obserwa-
cjê mikroskopow¹ zmian morfologii komórek, znakowa-
nie komórek barwnikami (w tym fluorochromami), test
przepuszczalnoœci b³ony komórkowej, rejestracjê zmian
w budowie b³ony komórkowej (translokacja fosfatydylo-
seryny), pomiar aktywnoœci kaspazy 3, wykrywanie in situ
fragmentacji DNA (ISEL – ang. in situ end labeling),
cytofotometriê przep³ywow¹; technikê ISNT (ang. in situ
nick translation, wykorzystuj¹ca DNA polimerazê I) lub
technikê TUNEL (ang. terminal deoxynucleotidyl trans-
ferase-mediated dUTP nick endlabeling, wykorzystuj¹-
c¹ terminaln¹ transferazê) [13,15,17,18]. Najlepsz¹ me-
tod¹ jest jakoœciowa ocena ultrastruktury komórki [13].
Poœredni¹ ocen¹ apoptozy jest analiza ekspresji genów
i ich produktów bior¹cych udzia³ w jej regulacji.
Proces apoptozy mo¿e byæ m.in. wywo³any przez:
hormony tarczycy i glikokortykosteroidy, cytokiny (TNF
– czynnik martwicy nowotworu), deficyt czynników wzro-
stowych i troficznych, czynniki cytotoksyczne (granzy-
my A i B, etopozyd, mitoksantron, difluorometyloorni-
tyna, antracykliny) i czynniki fizyczne (promieniowanie
jonizuj¹ce, hipertermia, ciœnienie hydrodynamiczne).
Mechanizmy apoptozy i jej znaczenie w regulacji sze-
regu fizjologicznych i patologicznych procesów komór-
kowych znajduj¹ siê w obszarze zainteresowania wspó³-
czesnej nauki. Badania te maj¹ bardzo istotne znaczenie
dla lepszego zrozumienia biologii komórki oraz rozwoju
i przebiegu wielu stanów chorobowych [19,20]. Genowa
regulacja stanu dynamicznej równowagi miêdzy podat-
noœci¹ i opornoœci¹ na apoptozê ma zasadnicze znacze-
nie dla wyjaœnienia dynamiki wzrostu zarówno komórek
prawid³owych jak i nowotworowych. Apoptoza zapew-
nia usuwanie z organizmu komórek z defektami gene-
tycznymi, zatem nastêpstwem jej zahamowania mo¿e byæ
proliferacja klonu komórek nieprawid³owych. Przyczyn¹
wzrostu nowotworu mo¿e byæ nie tylko zwiêkszona pro-
liferacja komórek, ale równie¿ wyd³u¿enie czasu ich prze-
¿ycia na skutek upoœledzenia procesów apoptozy. Za istot-
nym znaczeniem tego zjawiska przemawia obserwacja,
¿e wiele genów reguluj¹cych apoptozê wykazuje zabu-
rzenia ekspresji w procesach nowotworowych, a kluczo-
w¹ rolê w regulacji apoptozy odgrywaj¹ produkty bia³ko-
we genu P53 i Bcl2 [8,19-22,24,25].
Gen i bia³ko P53
Gen P53 nale¿y do genów supresorowych transfor-
macji nowotworowej (antyonkogenów), czyli tych, któ-
rych bia³kowe produkty hamuj¹ powstawanie fenotypu
nowotworowego [26]. Jest on zlokalizowany w chromo-
somie 17p13.1 i sk³ada siê z 11 eksonów [22,27]. W ge-
nomie wystêpuje w pojedynczej kopii. Produktem genu
jest bia³ko o masie 53 kD (st¹d nazwa genu i bia³ka),
które sk³ada siê z 393 aminokwasów. Prawid³owe bia³ko
P53 jest kluczowym negatywnym regulatorem cyklu ko-
mórkowego, a jego rola sprowadza siê przede wszystkim
do kontroli integralnoœci genomu, st¹d czêsto stosowane
jest dla niego okreœlane „stra¿nik genomu”. Udzia³ bia³-
ka P53 w transkrypcji genów, w regulacji cyklu komór-
kowego, kontroli naprawy DNA, inicjacji apoptozy i naj-
prawdopodobniej angiogenezy powoduje, ¿e jest ono nie-
zbêdne dla zachowania prawid³owych czynnoœci komórki
[14,24,27-30]. Aktywnoœæ biologiczna bia³ka P53 zale-
¿y od stopnia jego fosforylacji, a jego aktywn¹ form¹ jest
ufosforylowany homotetramer, tzw. „dzikie bia³ko” (bia³-
ko niezmutowane). Rozpoznaje ono œciœle okreœlone se-
kwencje DNA, dzia³aj¹c jak czynnik transkrypcyjny dla
niektórych genów jak: WAF1, gadd45 (ang. growth ar-
rest DNA damage inducible), RB1 (gen siatkówczaka
z³oœliwego), cykliny G oraz TSP-1 (trombospondyna 1)
[25,31]. Obecnoœæ uszkodzeñ DNA (indukowanych
m.in. przez czynniki fizyczne, chemiczne lub genotok-
syczne czynniki œrodowiskowe) powoduje akumulacjê
prawid³owego bia³ka P53 w j¹drze komórkowym i za-
blokowanie cyklu komórkowego w fazie G1, wyd³u¿aj¹c
tym samym czas na ich reperacjê przed wejœciem w fazê
S [24, 28]. Zatrzymanie cyklu w tej fazie odbywa siê na
drodze aktywacji transkrypcji genu WAF1/CIP1, który
koduje bia³ko o ciê¿arze cz¹steczkowym 21 kD (tzw. bia³-
ko P21). Ma ono zdolnoœæ hamowania aktywnoœci grupy
kinaz fosforyluj¹cych cykliny (cdk, ang. cyclin dependent
kinase), niezbêdnych do przejœcia komórki w fazê repli-
kacji DNA (faza S). Ponadto bia³ko P21, ³¹cz¹c siê z
podjednostk¹ polimerazy DNA o nazwie PCNA (ang.
proliferating cell nuclear antigen) hamuje jej dzia³anie,
wp³ywaj¹c bezpoœrednio na replikacjê [32]. Bia³ko P53
pobudza mechanizm reperacji uszkodzonego DNA.
Z jednej strony przypuszcza siê, ¿e dzia³a ono jako czyn-
nik transkrypcyjny z DNA, aktywuj¹c nie tylko gen ko-
duj¹cy bia³ko P21, ale tak¿e gen gadd45, którego pro-
duktem jest bia³ko blokuj¹ce wejœcie komórek w fazê S
i jednoczeœnie stymuluj¹ce szybkoœæ naprawy DNA (wy-
cinanie uszkodzonych fragmentów DNA) [32]. Z dru-
154
Otorynolaryngologia, 2002, 1(3), 151-160
giej strony bia³ko P53 oddzia³ywuje jako represor trans-
krypcji genów niezbêdnych do przebiegu cyklu komór-
kowego. To dwukierunkowe dzia³anie powoduje odwra-
calne zablokowanie tego cyklu, co u³atwia naprawê DNA,
wyd³u¿aj¹c czas, jaki komórki maj¹ na usuniêcie uszko-
dzeñ, zanim nast¹pi powielenie i podzia³ materia³u ge-
netycznego. Udzia³ bia³ka P53 w kontroli naprawy DNA
polega na modulowaniu aktywnoœci helikaz (enzymy usu-
waj¹ce uszkodzenia DNA), a w przypadku, gdy repera-
cja DNA zawodzi, bia³ko P53 uruchamia proces progra-
mowanej œmierci komórki (dlatego gen P53 okreœlany jest
czêsto jako gen „ku œmierci”) [8,22-25]. Bia³ko P53
uczestnicz¹c w mechanizmach reparacji DNA oraz in-
dukcji apoptozy, mo¿e istotnie wp³ywaæ na wra¿liwoœæ
komórek na chemioterapeutyki i promieniowanie joni-
zuj¹ce [33,34].
Mechanizmy indukcji apoptozy przez bia³ko P53
nadal nie s¹ do koñca wyjaœnione. Uwa¿a siê, ¿e w odpo-
wiedzi na sygna³ apoptotyczny bia³ko P53 aktywuje trans-
krypcjê wielu genów koduj¹cych, m.in. bia³ka Bax, PIG3,
Fas (Apo1), DR5 (Apo2) i IGF-BP3. Bia³ko P53 indu-
kuje apoptozê równie¿ poprzez hamowanie ekspresji genu
bcl2 (inhibitor apoptozy) lub w sposób niezale¿ny od
transkrypcji genów [8,21,24,34].
Prawid³owe bia³ko P53 ma okres pó³trwania 10-20
minut, natomiast bia³ko zmutowane przebywa w komórce
do 12 godzin i dziêki temu mo¿e byæ wykrywane meto-
dami IHC. Mutacje w genie p53 s¹ najczêstszym defek-
tem genetycznym stwierdzanym w nowotworach wszyst-
kich typów u ludzi, a do tej pory opisano ich ponad tysi¹c
[11,35]. G³ównie s¹ to mutacje punktowe zmian sensu
(powoduj¹ce redukcjê funkcjonalnych tetramerów bia³ka),
insercje i mutacje nonsensowe lub delecja niezmutowa-
nego allelu p53, a ró¿nice w aktywnoœci biologicznej
zmienionych form bia³ka zale¿¹ od rodzaju i miejsca
mutacji [35,36]. Zmutowane bia³ko nie traci zdolnoœci
do tworzenia tetrameru z prawid³owym bia³kiem P53,
ale nie ma ju¿ mo¿liwoœci specyficznego wi¹zania siê
z DNA, przez co nie pe³ni roli regulatora transkrypcji.
Stwierdzono, ¿e nowotwory ró¿ni¹ siê spektrum muta-
cyjnym genu p53, co mo¿e wynikaæ z ekspozycji na od-
mienne karcynogeny [35].
Do zmiany aktywnoœci funkcjonalnej „dzikiego bia³-
ka” P53 mo¿e tak¿e dochodziæ na skutek jego wi¹zania
siê z produktami wirusów onkogennych (powsta³y hete-
rodimer równie¿ nie jest aktywny jako regulator trans-
krypcji), a tak¿e w wyniku wzmocnionej ekspresji genu
mdm2, którego produkt jest inhibitorem bia³ka P53.
Konsekwencj¹ braku prawid³owo funkcjonuj¹cego bia³-
ka P53 jest zniesienie jego wp³ywu na proces apoptozy,
utrata kontroli nad podzia³ami komórki i napraw¹ uszko-
dzeñ DNA, prowadz¹ca do gromadzenia siê mutacji oraz
aberracji chromosomowych i w nastêpstwie – szybka se-
lekcja komórek o fenotypie nowotworowym, czyli trans-
formacja nowotworowa [8,28,37]. Mimo, ¿e rola bia³ka
P53 w procesie apoptozy nie jest do koñca poznana, obec-
noœæ prawid³owej jego formy jest niezbêdna dla przebie-
gu programowanej œmierci komórki wywo³anej czynni-
kami uszkadzaj¹cymi DNA. Stwierdzono równie¿ wp³yw
genu P53 i jego bia³ka na proces angiogenezy nowotwo-
rowej. Pojawienie siê fenotypu angiogennego w komór-
kach nowotworowych ma byæ zwi¹zane z wyst¹pieniem
mutacji w genie P53. Znosz¹ one wielokierunkow¹ ak-
tywnoœæ supresyjn¹ genu P53 i prowadz¹ m.in. do uak-
tywnienia genu VEGF, który uwa¿any jest za jeden z naj-
silniejszych mitogenów komórek œródb³onka [38-40].
Czynnik ten z kolei aktywuje równie¿ szereg innych ge-
nów bior¹cych udzia³ w neowaskularyzacji, co sprzyja
utrwalaniu siê fenotypu angiogennego w komórkach no-
wotworowych i ci¹g³ej, niepohamowanej stymulacji an-
giogenezy w guzie. W badaniach doœwiadczalnych stwier-
dzono, ¿e wprowadzenie do komórek nowotworowych
Ryc. 1. Ekspresja bia³ka P53 widoczna w wiêkszoœci komórek raka krtani
(odczyn immunoperoksydazowy; pow. 100x)
Ryc. 2. Ekspresja bia³ka P53 widoczna w wiêkszoœci komórek raka krtani pod
postaci¹ drobnych ziaren w j¹drach (odczyn immunoperoksydazowy, powiêk-
szenie 400x)
Gryczyñski M., Wioletta Pietruszewska W.: Wybrane aspekty apoptozy i proliferacji komórkowej raka krtani
155
prawid³owego genu P53 znosi aktywnoœæ genu VEGF,
poniewa¿ prawid³owe bia³ko P53 jest represorem trans-
krypcji tego genu [41]. Proces angiogenezy jest w orga-
nizmie stale hamowany przez trombospondynê-1, wie-
lofunkcyjn¹ glikoproteinê wystêpuj¹c¹ w macierzy poza-
komórkowej i hamuj¹c¹ proliferacje i migracje komórek
œródb³onka naczyñ. Wydaje siê, ¿e jej synteza jest regu-
lowana przez bia³ko P53. W przypadku, gdy stê¿enie bia³-
ka P53 zmniejsza siê, iloœæ trombospondyny równie¿ ma-
leje, co stymuluje podzia³y komórek œródb³onka naczyñ
krwionoœnych s¹siaduj¹cych z nowotworem i pobudza eks-
presjê genów, których produkty (np.: hormony, czynniki
wzrostu i interferony) u³atwiaj¹ komórkom guza szybki
wzrost i tworzenie nacieków inwazyjnych [40].
W badaniach w³asnych (praca w druku) ekspresjê bia-
³ka P53 stwierdzono u 117 chorych na raka krtani
(77,48%) (ryc. 1, ryc. 2).
Zaobserwowano znamienne zale¿noœci miêdzy
zwiêkszon¹ ekspresj¹ tego bia³ka a wielkoœci¹ guza pier-
wotnego (p=0,01) i wystêpowaniem wznowy miejscowej
(p=0,003), a zale¿noœæ z obecnymi przerzutami w wê-
z³ach ch³onnych by³a bliska istotnoœci (p=0,05). Zarówno
ca³kowity, jak i wolny od choroby, czas prze¿ycia by³ zna-
miennie krótszy u chorych z wysok¹ ekspresj¹ bia³ka P53.
nab³onkowe wra¿liwe na bodŸce hormonalne) [20,44,45].
Fizjologiczna rola tego bia³ka polega na hamowaniu apop-
tozy, co w komórkach niezró¿nicowanych umo¿liwia pra-
wid³owy przebieg morfogenezy oraz procesów ró¿nico-
wania, natomiast w komórkach ju¿ zró¿nicowanych po-
zwala na ich odpowiednio d³ugie prze¿ycie [20]. Bia³ko
Bcl2 uczestniczy w hamowaniu apoptozy towarzysz¹cej
zarówno procesom fizjologicznym jak i nowotworowym
[19,20]. Zwiêkszon¹ ekspresjê tego bia³ka wykrywa siê
zarówno w niektórych procesach rozrostowych uk³adu
ch³onnego, jak i w innych nowotworach [10,12]. Me-
chanizmy dzia³ania bia³ka Bcl2 nie s¹ do koñca wy-
jaœnione. Udowodniono, ¿e mo¿e ono podejmowaæ dzia-
³anie w dowolnej fazie cyklu komórkowego i nie posiada
wp³ywu na proliferacjê [20]. Sugeruje siê mo¿liwoœæ in-
gerencji tego bia³ka w rozmieszczenie i zmianê stê¿enia
jonów wapnia, wp³yw na aktywnoœæ i dystr ybucjê endo-
nukleaz lub kinaz fosforyluj¹cych cykliny [20,43], a efekt
antyapoptotyczny osi¹ga ono najprawdopodobniej po-
przez hamowanie produkcji wolnych rodników i/lub
wp³yw na redystrybucjê jonów wapniowych w komórce
lub na zachowanie integralnoœci b³ony mitochondrialnej
i zapobieganie uwalnianiu cytochromu c. Stwierdzono,
¿e bia³ko P53 reguluje ekspresjê genów Bcl2 i Bax, a apop-
toza indukowana przez prawid³owe bia³ko P53 jest przy-
najmniej czêœciowo zwi¹zana z hamowaniem ekspresji
genu Bcl2 i pobudzaniem ekspresji genu Bax [20]. Wy-
daje siê, ¿e zmutowana forma bia³ka P53 mo¿e zacho-
waæ hamuj¹cy wp³yw na ekspresjê Bcl2, ale jednoczeœnie
sama mo¿e dzia³aæ jako supresor programowanej œmierci
komórki [20,45]. Bia³ko Bcl2 mo¿e jednak oddzia³ywaæ
na apoptozê tak¿e na drodze niezale¿nej od P53.
Uwa¿a siê, ¿e spoœród wszystkich znanych bia³ek,
Bcl2 jest najsilniejszym inhibitorem apoptozy wywo³a-
nej przez ró¿ne czynniki (glikokortykosteroidy, chemio-
terapeutyki, hipertermia, deficyt czynników wzrostowych
lub promieniowanie jonizuj¹ce) [4,10,12].
W procesach nowotworowych nadekspresja bia³ka
Bcl2 mo¿e powodowaæ opornoœæ nowotworów na che-
mio- i radioterapiê przez hamowanie procesu apoptozy
w komórkach guza [10,12].
W badaniach w³asnych (praca w druku) ekspresjê bia-
³ka Bcl2 stwierdzono u 68 chorych (45,0%) na raka krta-
ni (ryc. 3, ryc. 4).
Nie zaobserwowano istotnych zale¿noœci miêdzy eks-
presj¹ tego bia³ka a cechami klinicznymi i histologiczny-
mi nowotworu oraz czasem prze¿ycia chorych (p>0,05),
poza wysoce znamienn¹ zale¿noœci¹ miêdzy dodatni¹
ekspresj¹ bia³ka Bcl2 a obecnoœci¹ wznów miejscowych
(p<0,001). Nale¿y zastanowiæ siê nad przydatnoœci¹ ba-
dania ekspresji bia³ka Bcl2 w raku krtani. Wykazano bo-
wiem, ¿e bia³ko Bcl2 ma hamuj¹cy wp³yw na proces apop-
tozy bêd¹cej wynikiem chemioterapii lub napromienia-
nia [46,47]. Ocena ekspresji tego bia³ka mo¿e pomóc
w selekcji tych nowotworów, które s¹ potencjalnie oporne
Gen i bia³ko Bcl2
Gen Bcl2 nale¿y do protoonkogenów, których uszko-
dzenie objawia siê niekontrolowanym wzrostem ich ak-
tywnoœci lub ekspresji, co prowadzi do powstania nowo-
tworu. Zosta³ on wykryty w wyniku translokacji chro-
mosomowej t [14,18] stwierdzonej w ch³oniaku limfo-
cytów B (ang. B Cell Lymphoma) [42]. Gen Bcl2 nale¿y
do rodziny Bcl2, do której zalicza siê geny pobudzaj¹ce
apoptozê (jak Bax, Bad, Bcl-Xs, Bak) i hamuj¹ce j¹ (m.in.
Bcl-2, Bcl-X, Bcl-w, Brag-1, Mcl-1). Wszystkie one maj¹
dwie konserwatywne ewolucyjnie domeny: BH1 i BH2
uczestnicz¹ce w oddzia³ywaniach miêdzy poszczególny-
mi cz³onkami rodziny. Ich bia³kowe produkty ³¹cz¹ siê
w homo- lub heterodimery (np. Bcl2-Bcl2, Bax-Bcl2,
Bax-Bax). Stwierdzono, ¿e przewaga homodimerów Bcl-
2 decyduje o prze¿yciu, podczas gdy przewaga Bax –
o œmierci komórki [4,20]. Prawid³owy gen Bcl2 umiej-
scowiony jest na chromosomie 18q21, jednak w wyniku
translokacji zostaje przeniesiony, co prowadzi do zwiêk-
szonej ekspresji i nadprodukcji jego bia³kowego produk-
tu. Bia³ko Bcl2 o masie 26 kD, zbudowane jest z 239
aminokwasów [43]. Jest ono zakotwiczone w b³onach
mitochondrium, j¹dra i siateczki œródplazmatycznej.
W warunkach prawid³owych bia³ko to wystêpuje m.in.
w niezró¿nicowanych tkankach zarodkowych na okre-
œlonych etapach rozwoju i w komórkach stref proliferu-
jacych (np. komórki macierzyste uk³adu krwiotwórcze-
go, warstwy podstawnej naskórka, przewody wyprowa-
dzaj¹ce gruczo³ów wydzielania wewnêtrznego, komórki
[ Pobierz całość w formacie PDF ]